Nature | TCR特异性识别pMHC的结构分析

可溶性双特异性T细胞重定向融合蛋白（ImmTAC）被FDA批准用于转移性葡萄膜黑色素瘤以来，有关TCR的研究越来越多。T细胞受体（TCR）对抗原肽MHC（pMHC）分子的识别引发了T细胞介导的免疫反应，结构表征是理解TCR-pMHC特异性相互作用，和为关联治疗学发展提供信息的关键。迄今为止报道的TCR-pMHC复合物的结构大多都是通过生成可溶性胞外结构域的X射线衍生技术确定的。尽管在工程蛋白结构、表达策略和结晶优化方面取得了进展，但这些复合物的成功表达结晶仍然是一项艰巨的任务。近年来单粒子冷冻电镜（CryoEM）迅速发展可用于TCR-CD3和pMHC复合物的表征，这里将报告两种α/βTCR-CD3复合物的冷冻电镜结构，它们可识别HLA-A2限制性肿瘤相关抗原MAGE-A4（230–239）。还关注了在没有TCR的情况下，含有MAGE-A4（230–239）肽和相关的MAGE-A8（232–241）肽的pMHCs的冷冻电镜结构，这为TCR特异性识别MAGE-A4提供了结构解释，这些发现为TCR识别临床相关的癌症抗原提供了见解，并证明了冷冻电镜在TCR-pMHC相互作用的高分辨率结构分析中的实用性。

TCRs通常表达为α/β或γ/δ链的异二聚体，与下游传导信号的三种CD3二聚体（CD3εδ、CD3εγ、CD3ζζ）形成复合物，将近25年的晶体学研究揭示了TCR-pMHC识别的结构基础及其与T细胞免疫反应的关系，其中TCR每条链上的三个互补决定区（CDR）与pMHC分子结合，CDR1和CDR2环主要与MHC分子相互作用，CDR3环与MHC嵌入肽结合，控制抗原识别引发免疫反应。阐明抗原特异性的结构基础对具有治疗潜力的TCRs非常重要，在一项临床试验中，识别MAGE-A3的TCR-T细胞疗法对源于Titin的肽（在心脏中表达）交叉反应性导致两人死亡[Cardiovascular toxicity and titin cross-reactivity of affinity-enhanced T cells in myeloma and melanoma]。随后的结构研究表明，尽管在9个残基中的4个残基处存在序列差异，但Titin肽在MHC凹槽内与MAGE-A3肽的构象密切相似，这最终导致了TCR交叉反应。原则上，结构信息可以通过促进脱靶肽的预测和引导增强TCR-pMHC相互作用的结构来提高基于TCR治疗的安全性和有效性。

结果

全长PN45545 TCR-CD3的CryoEM结构

从用MAGE-A4（230–239）肽免疫的人源化VelociT小鼠中分离出两个α/βTCR，PN45545和PN45428。首先侧重研究了PN45545，在HEK293细胞中表达了全长PN45545 TCR-CD3εδγζ复合物并纯化。确定PN45545 TCR-CD3复合物的冷冻电镜结构为3.0 Å分辨率（图1a,b）。在TCRα（N58，N150，N184，N195）、TCRβ（N84，N107，N184）、CD3δ（N38，N74）和CD3γ（N52，N92）上鉴定了N-连接的聚糖密度（图1b），在TCRβ、CD3γ和CD3ζ亚基的TM螺旋之间存在脂质密度，由于其形状且存在纯化缓冲液中，我们将其命名为半琥珀酸胆固醇酯（CHS）（图1a,c）。CD3亚基的细胞质尾部在冷冻电镜图中没有被解析，可能是由于灵活性。TCR恒定区和CD3亚基的结构和排列几乎与之前发表的TCR-CD3复合物结构相同。然而，TCR可变区和恒定区之间的转角略有不同，可能因其具有不同的Vα/Vβ序列（图1c–e）。结合之前不同α/βTCR的冷冻电镜研究，这些表明PN45545 TCR-CD3复合物结构支持TCR-CD3的整体结构和组装不受TCR可变区序列差异影响的观点。

图1  PN45545-TCR CD3复合物的冷冻电镜结构

全长PN45545和PN45428的TCR-CD3复合物与HLA-A2/MAGEA4（230–239）的冷冻电镜结构

为了深入了解MAGE-A4（230–239）肽能被两种不同的TCR识别的结构基础，确定了与全长PN45545和PN45428 TCR-CD3复合物连接的HLA-A2/β2M/MAGE-A4（230-239）（以下称为MAGEA4-pMHC）的冷冻电镜结构，分辨率分别为2.7和3.3 Å（图2）。这些结构是用抗β2M单克隆抗体2M2的Fab片段存在的情况下测定的，其被用作基准标记以增强MAGEA4-pMHC的冷冻EM信号（图2a,d）。冷冻电镜图显示了MAGE-A4肽和附近区域的清晰侧链密度，从而能够精确地建立模型并评估TCR-pMHC表面氨基酸水平的相互作用（图2b,e）。当比较连接和未连接的PN45545 TCR-CD3结构时，唯一不同的是CDR区域。

图2  TCR-CD3与MAGEA4-pMHC复合物的冷冻电镜结构

PN45545和PN45428的整体TCR-pMHC结合方向遵循典型对接极性，其中Vα区域定位于HLA-α2，Vβ区域定位于HLA-α1（图2c,f）。然而，两种TCR以不同的结合模式与pMHC结合，其特征在于PN45545和PN45428的对接角度分别为45°和94°（图2c,f,g）。尽管PN45545和PN45428具有不同的对接角度，但它们都与MAGEA4-pMHC结合，使得CD8αβ的Ig结构域C末端将朝向T细胞膜，有利于TCR/CD3/CD8的顺式构型和pMHC/CD8的反式结合，这一结果说明了共受体的结合可以约束适应一系列TCR/pMHC结合角度。尽管它们的对接角和CDR序列是不同的（图3a），但两种TCR的结合足迹都向MAGE-A4肽的N末端移动（图3b–e）。在这两种情况下，TCR结合（4 Å原子间距离）仅限于肽残基D4、G5和R6，而突起暴露肽（E7-V10）的C末端部分没有结合，这表明它在TCR识别中没有直接作用，该肽的N-末端部分和临近的HLA区域在人类和人源化小鼠模型中可能具有免疫优势。

图3  TCR-MAGEA4-pMHC相互作用

PN45545和PN45428的肽结合主要由β链CDR3介导。在PN45545 TCR 存在时，CDR3β残基F95和Y99分别与肽残基R6和D4产生明显的阳离子-π和氢键相互作用，CDR3β中的其他残基也与肽残基G5发生范德华相互作用。CDRs 1α（S31）和3α（G97）为肽D4提供了额外的结合（图3d）。对于PN45428，CDR3β的E103与肽R6形成盐桥（氢键的一种），而CDR3β中的其他残基结合肽G5和R6的骨架原子。PN45428 α链残基R31和N97分别与肽D4形成盐桥和极性相互作用（图3e）。两种结构中的肽构象除了通过特定TCR特异性相互作用稳定的不同R6侧链旋转异构体外几乎相同（图3f）。

TCR识别高度相似的MAGE-A4和MAGE-A8之间的结构基础

识别HLA-A2/MAGE-A4（230–239）的TCR先前已表现出与MAGE-A8（232–241）具有类似的HLA-A2限制性肽的交叉反应。MAGEA4（230–239）和MAGEA8（232–241）肽的区别仅在于两个保守取代（V2L和T9S），其中V2L被掩埋，T9S表面适度暴露。为了评估MAGE-A4/MAGE-A8对PN45545和PN45428的交叉反应性，首先在原代人T细胞中表达TCR，并用pMHC四聚体试剂通过流式细胞术进行分析。有趣的是，PN45428显示出与HLA-A2/MAGE-A8（232–241）的结合，与HLA-A2/MAGE-A4（230–239）有较低程度的结合（图4a）。然而，对于PN45545，没有检测到HLA-A2/MAGE-A8的结合信号。为了证实PN45428对MAGE-A8抗原的亲和力降低，使用稳态表面等离子体共振（SPR）检测洗涤剂溶解的PN45428 TCR-CD3和MAGEA4/MAGEA8-pMHC的结合亲和力（图4b,c），与MAGE-A8相比，PN45428对MAGE-A4高出约10倍的亲和力，PN45445对MAGE-A4表现出约70倍的亲和性，这与通过流式结果中PN45545 TCR的更高特异性一致（图4a）。

图4  与MAGEA8-pMHC相比，TCR与MAGEA4-pMHC的优先结合

为了研究两个取代（V2L和T9S）中哪一个负责TCRs优先结合MAGE-A4而不是MAGE-A8，通过流式检测了单取代肽V2L或T9S的pMHC四聚体与表达PN45545或PN45428 TCRs的Jurkat细胞的结合（图6）。结果显示相较野生型MAGE-A4肽，V2L突变显示出与PN45545的结合可忽略不计，并且与PN45428的结合减少。T9S突变显示PN45545和PN45428的结合水平与野生型MAGE-A4相似。因此，TCRs对HLA-A2/MAGE-A8的亲和力降低可归因于V2L残基取代。两种TCR对MAGEA4（230–239）比对MAGEA8（232–241）的特异性高不能通过PN45545或PN45428的肽结合模式直接解释（图3b–e），因为不同的两个残基都不与TCR结合。为了进一步研究这两个肽表位之间的结构差异，我们在没有TCR的情况下对MAGEA4和MAGEA8-pMHCs进行了冷冻电镜分析。使用单链二硫键稳定的pMHC，并将抗β2M抗体2M2的Fab片段作为基准添加到样品中，以增强冷冻电镜EM信号处理。3.4 和3.1 Å分别获得了MAGEA4和MAGEA8-pMHCs的Å分辨率重建（图5a,b），图谱充分解析确定HLA嵌入肽的构象，中心R6残基的侧链没有很好地分解，这与其在没有TCR的情况下的柔韧性一致。MAGEA4和MAGEA8肽的结构高度相似（图第5c）印证了它们的保守序列高度相似。最显著的差异出现在残基D4处，在MAGE-A4肽中D4侧链向下投射到HLAα2螺旋，而在MAGE-A8肽中它向上突出，远离HLA凹槽，似乎与HLA-α1处的R65侧链形成盐桥相互作用（图5 d–f）。不同的D4构象可归因于V2L位的取代，MAGEA8中较粗的亮氨酸侧链导致肽骨架的轻微重塑，这有利于肽D4/HLA R65盐桥的形成。

图5  MAGEA4和MAGEA8-pMHCs与2M2-Fab复合物的冷冻电镜结构

MAGEA4和MAGEA8-pMHCs的结构表明残基D4的不同构象是TCR特异性区分的关键。事实上，两种TCR都与肽D4侧链进行多次接触，此外，两种TCR通过CDR2β中的残基与HLA-A2α1螺旋残基R65直接相互作用。对于PN45545，来自CDR2β的Y50似乎与R65形成阳离子-π相互作用（图5g），而在PN45428中，来自CDR1β的E52与R65产生静电相互作用（图5h）。这些相互作用可能使得HLA-A2/MAGEA8的结合受到损害。总之，这些结构数据表明，两种TCR对MAGE-A4的优先结合可能是由于相互作用，这些相互作用要求肽D4残基处于向下的构象，使其不与HLA残基R65相互作用。MAGE-A8若要形成与MAGE-A4同样的肽构象将需要破坏D4-R65盐桥（图5f），这在能量上可能是不利的。

图6  表达PN45545或PN45428 TCR的Jurkat与MAGEA4和MAGEA8-pMHC四聚体的流式分析

讨论

在这里证明了CryoEM可以对TCR-pMHC识别产生高分辨率的见解，利用冷冻电镜展示了TCRs如何在含有CD3亚基的全长信号复合物的背景下与pMHC结合，从而可以评估抗原和T细胞受体的相对位置，分析其特异性结合的潜在机制，这在使用可溶性TCRs晶体进行结构测定时是不可能的。总的来说，CryoEM在TCR-pMHC识别结构研究中的应用，可以加速TCR机理研究的进展，并有助于癌症免疫疗法的发展。

参考文献：

[1]Structural analysis of cancer-relevant TCR-CD3 and peptide-MHC complexes by cryoEM.Nature Communications.2401 (2023).

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